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LA
MICROPROPAGACIÓN EN LA MEJORA DE PATRONES DE AGUACATE (Persea americana Mill.):
PROBLEMAS Y LIMITACIONES
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Pliego-Alfaro1; A. Barceló-Muñoz2; E. Simón-Pérez2;
G. de la Viña-Nieto1; C. Sánchez-Romero2; R.
Perán-Quesada2
[1]Departamento
de Biología Vegetal, Campus de Teatinos s/n. 29071 Málaga. FAX: 34.952.132000.
2C.I.F.A.
Cortijo de la Cruz, Churriana, 29140 Málaga. España FAX: 34.952.621868. Correo
electrónico: laboratorio@olinet.es
Las podredumbres de raíz causadas por Phytophthora cinnamomi y Rosellinia necatrix son un serio
problema en las plantaciones de aguacate, y se están haciendo considerables
esfuerzos para obtener material tolerante a estas enfermedades. Actualmente, el
material seleccionado se propaga por el método de Frolich, una técnica que
requiere el injerto en patrón nodriza seguido de la etiolación del brote que se
pretende enraizar. El uso de
alternativas biotecnológicas puede ser de gran interés en programas de mejora
de aguacate. La micropropagación sería de gran utilidad, tanto para la
producción a gran escala de patrones clonales como para la multiplicación de
genotipos que, tras su revitalización in
vitro, podrían propagarse por métodos
convencionales. El éxito en la micropropagación de especies leñosas va
ligado al uso de material juvenil o material adulto revitalizado. Explantos
juveniles de aguacate proliferan adecuadamente in vitro en presencia de 4,44 mM benciladenina; sin embargo, los
explantos de origen adulto, obtenidos de árboles revitalizados mediante podas
severas, presentan problemas de necrosis apical, lo que hace necesaria la
utilización de medios líquidos o de doble-fase para su multiplicación in vitro. El enraizamiento del material
juvenil se consigue tras incubar los brotes durante 3 días en presencia de
ácido indol-3-butírico, 4,92 mM, y posterior transferencia a medio sin auxina. Los
brotes de origen adulto presentan una baja capacidad de enraizamiento; sin
embargo, la utilización de material revitalizado mediante podas severas o
microinjertos y la incubación en medios líquidos suplementados con auxina han
permitido obtener porcentajes de enraizamiento similares a los del material
juvenil (80-90%).
Palabras clave: Persea americana, embriogénesis somática, multiplicación in vitro, portainjertos.
Abreviaturas: Ácido abscísico (ABA), ácido
indol-3-acético (AIA), ácido indol-3-butírico (AIB), ácido 2,3,5,
triyodobenzoico (TIBA), benciladenina (BA), Murashige y Skoog (MS),
polietilenglicol (PEG).
Root rots caused by Phytophthora cinnamomi and Rosellinia
necatrix are serious problems in avocado orchards, and considerable efforts
are being made to find material tolerant to these diseases. Currently, selected
material is being propagated by the Frolich method, a technique which requires
grafting in a nurse seedling followed by etiolation of the shoot to be rooted.
The use of biotechnology could be of great interest in rootstock avocado
breeding programmes. Micropropagation could be very useful for mass production
of clonal rootstocks or to revitalice adult material which could later on be
multiplied by conventional means. The success in micropropagation of woody
perennials is generally linked to the use of juvenile or revitalized adult
material. Juvenile avocado explants proliferate adequately in vitro in the presence of 4.44 mM benzyladenine; however, explants of adult origen,
obtained from trees previously revitalized by severe pruning, show apical
necrosis, and liquid or double-phase media are required to overcome this
problem. Rooting of juvenile material
has been accomplished after incubating the shoots for three days in the
presence of 4.92 mM
indole-3-butyric acid, followed by transfer to auxin free-medium. Shoots of
adult origin show a rather low rooting capacity; however, use of material
previously revitalized, by severe pruning or micrografting, and the incubation
on auxin supplemented liquid media, has allowed the obtention of rooting
percentages similar to those of juvenile material (80-90%).
Key words: Persea americana, in
vitro
multiplication, rootstocks, somatic embryogenesis.
El uso de alternativas biotecnológicas puede ser de
gran interés en programas de mejora de aguacate (Pliego-Alfaro y Bergh, 1992).
La micropropagación sería de utilidad para producción a gran escala de plantas
clonales, mientras que la inducción de variantes somaclonales podría ser un
camino para seleccionar material tolerante a patógenos de suelo (van den Bulk,
1991), especialmente, si tenemos en cuenta que la tolerancia a P. cinnamomi ocurre a nivel celular de
forma similar a lo observado en la planta completa (Phillips et al, 1991). Por otra parte, la
transformación genética permite introducir cambios específicos en el genoma de
la célula sin perturbar su constitución genética (Schuerman y Dandekar, 1993),
aunque va a ser necesario un conocimiento en profundidad de los mecanismos de
regulación y expresión génica para obtener individuos de alto valor
biotecnológico (Jorgensen, 1993). El número de especies leñosas susceptibles de
transformación está creciendo rápidamente (Gardner, 1993; Schuerman y Dandekar,
1993). Recientemente, se han transformado embriones somáticos de aguacate con
el gen de la b- glucuronidasa, pero no ha sido
posible la regeneración de plantas (Cruz-Hernandez et al., 1998).
En este trabajo pretendemos reflejar las
contribuciones de nuestro grupo de investigación en la morfogénesis in vitro del aguacate, y su utilización
para obtener material seleccionado que muestre buen comportamiento frente a las
podredumbres radicales.
La multiplicación de plantas mediante proliferación
de brotes axilares es el método de micropropagación más fiable en términos de
estabilidad genética del material obtenido (George, 1993). En especies leñosas,
incluido el aguacate, la capacidad morfogenética es mayor en material juvenil
que en adulto (Arrillaga et al.,
1991; Pliego-Alfaro y Murashige, 1987), por eso, al tratar de poner a punto un
método de micropropagación en este tipo de plantas, inicialmente se suelen
llevar a cabo experimentos con material juvenil y posteriormente, los
resultados obtenidos sirven de base para la multiplicación de explantos de
origen adulto.
Barceló-Muñoz et
al., (1990) utilizaron BA para inducir proliferación de material juvenil de
aguacate; así, concentraciones en el rango 4,44-8,88 mM inducen una tasa de multiplicación de 2-3X. Dado
que la presencia de BA en el medio de multiplicación origina miniaturización de
los brotes, se requiere una fase de elongación antes del enraizamiento. Esta
elongación se puede conseguir prolongando el período de subcultivo hasta 8 semanas
o cultivando los brotes en medio líquido en presencia de dosis más bajas de BA
durante dos semanas.
El establecimiento in vitro de brotes adultos requiere una reducción de la
concentración de macroelementos de la formulación MS y un suplemento de BA (1,3
mM) (Pliego-Alfaro et al, 1987). El cultivo de estos brotes
en medio sólido con dosis superiores de BA (4,44 mM) da lugar a la aparición de necrosis en los ápices
de los brotes. Sin embargo, la utilización de un medio de doble fase permite
solucionar este problema, aunque tras el cultivo continuado en estas
condiciones los brotes muestran síntomas de hiperhidricidad (Pliego-Alfaro, et al., 1987). Para solventar esta
anomalía, Barceló-Muñoz et al. (1999)
han desarrollado un método de multiplicación en el que se alternan el cultivo
de brotes durante dos semanas en medio líquido en rotor en presencia de dosis
bajas de citoquinina, con el cultivo en medio de doble fase durante seis
semanas. Este procedimiento ha permitido multiplicar con éxito material de aguacate
en fase adulta de desarrollo.
Microestaquillas juveniles de aguacate no requieren
auxina para enraizar (Pliego-Alfaro, 1988), sin embargo, una breve exposición a
4,92 mM AIB ha tenido efectos positivos
en la formación de raíces (Barceló-Muñoz et
al., 1990). García-Gómez et al.
(1994) cuantificaron los niveles de auxina en forma libre (AIA) y conjugada
(AIA-aspartato) durante el enraizamiento de microestaquillas juveniles de cv.
Topa-Topa, tratadas, o no, con AIB. En los brotes utilizados como control, los
niveles de AIA permanecieron constantes durante el proceso de enraizamiento,
mientras que en los tratados con AIB, el contenido endógeno de AIA se duplicó
durante los seis primeros días. El tratamiento de estos brotes con TIBA, un
inhibidor del transporte polar de auxina, indujo un ligero descenso de los
niveles de auxina libre e inhibió la formación de raíces. El contenido endógeno
del conjugado AIA-aspartato aumentó en las microestaquillas control y en las
tratadas con AIB antes de la diferenciación de los primordios radiculares y
después disminuyó progresivamente. Sin embargo, en las microestaquillas
tratadas con TIBA no se observó
incremento de los niveles de AIA-aspartato. Estos resultados muestran
que debe ocurrir un aumento en los niveles de AIA durante las primeras fases
del enraizamiento, mientras que la formación del conjugado sería un mecanismo
para detoxificar el exceso de auxina libre.
Además de la formación de conjugados, la actividad
peroxidasa juega un importante papel en la regulación de los niveles de auxina
durante el proceso de enraizamiento (Berthon et al., 1989). Los
trabajos de García-Gómez et al. (1995) han mostrado que en aguacate, la
actividad peroxidasa de la hoja (fracción soluble, y unida a pared celular)
permanece constante durante el proceso de enraizamiento; sin embargo, la
actividad peroxidasa (fracción soluble) en la parte basal de los brotes se
duplicó después de 3 días y permaneció a niveles elevados hasta el final del
proceso de enraizamiento. Los estudios histológicos llevados a cabo para
localizar esta actividad enzimática mostraron que estaba presente en todos los
tejidos de la estaquilla, aunque los haces vasculares y la epidermis daban las
reacciones más fuertes. Las peroxidasas están implicadas en el proceso de formación
de la pared celular (Lamport, 1986), así como en la formación de células de
xilema (Miller et al., 1985); por
consiguiente, las peroxidasas, durante el enraizamiento in vitro de aguacate, podrían estar implicadas tanto en la
oxidación de conjugados de auxina, tal y como se ha observado en Populus tremula (Plüss et al., 1989), como en los procesos de
formación de paredes celulares y
xilogénesis inherentes a la diferenciación de raíces.
Los brotes de origen adulto son difíciles de
enraizar. Subcultivos sucesivos en medio de multiplicación han mejorado la
capacidad de enraizamiento de brotes de otras especies (Sriskandarajan et al. 1982), pero no de aguacate
(Pliego-Alfaro et al. 1987). Sin
embargo, el injerto de yemas adultas en semillas germinadas in vitro ha dado lugar a brotes con
mejor capacidad de enraizamiento. En el caso del portainjerto Duke-7, el 50% de
los brotes injertados enraizó frente al 0% de los controles no injertados. El
reinjerto de los brotes adultos (hasta 3 veces) no mejoró la capacidad de
enraizamiento (Pliego-Alfaro y Murashige, 1987). Sin embargo, en el caso del
portainjerto G.A.-13, Barceló-Muñoz, (1995) fue capaz de obtener un 90% de
enraizamiento de los brotes adultos tras 16 injertos sucesivos en material
juvenil. Sorprendentemente, tanto en el caso del portainjerto Duke 7 como en el
del G.A.-13, los brotes adultos rejuvenecidos mostraban una pobre respuesta a
las condiciones que favorecían la multiplicación del material en estado
juvenil.
Hood y Libby (1978) han propuesto que la metilación
de genes reguladores puede estar implicada en los procesos de maduración y
rejuvenecimiento mientras que Huang et al.
(1990) sostienen que las sustancias que se transmiten a través de la unión de
injerto deben ser suficientemente pequeñas y resistentes a degradación
enzimática, y que el ADN circular de bajo peso molecular abundante en plastos,
mitocondrias y núcleo podría ser un buen candidato.
La textura del medio de cultivo juega un papel muy
relevante en el enraizamiento del material adulto. Así, mientras en medio
sólido el enraizamiento de brotes procedentes de árboles adultos revitalizados
mediante podas severas no supera el 30%, la utilización de medio líquido en
rotor (5 rpm) durante los tres días en que los brotes son expuestos a auxina
eleva el porcentaje de enraizamiento al 85% (Barceló-Muñoz, 1995).
De la Viña et
al. (1999) han estudiado el efecto de la concentración de sacarosa y los
niveles de CO2 en la fisiología de plantas juveniles. Con una
concentración de sacarosa 87,6 mM, el contenido de Rubisco disminuyó de forma
drástica en relación a las plantas que crecían en presencia de 14,6 mM sacarosa y este descenso se incrementó en
atmósfera enriquecida en CO2; sin embargo, tras el transplante a
invernadero, la tasa de supervivencia de las plantas que habían crecido en
presencia de baja sacarosa/alto CO2 no fue superior a la de las
plantas que habían crecido en presencia de alta sacarosa/bajo CO2
(70%). Estos datos sugieren que la mejora de crecimiento obtenida elevando la
concentración de CO2 in vitro
no es suficiente para incrementar la tasa de supervivencia obtenida en la fase
de aclimatación; esto podría ser debido a la relativamente baja cantidad de
reservas de azúcares presente en estas plantas. En este línea, Capellades
(1991) observó una mejora en la supervivencia de plantas micropropagadas de
rosa, tras ser cultivadas en presencia de una alta concentración de sacarosa, a
pesar de que en estas condiciones se disminuía la tasa de fotosíntesis. Por
otra parte, la inoculación con hongos formadores de micorriza favorece la
aclimatación de material micropropagado. En plantas juveniles, la inoculación
con Glomus fasciculatum mejoró el
sistema radicular, incrementó la relación brote/raíz y aumentó de forma
considerable la absorción de macroelementos (N,P,K) (Vidal et al., 1992). La inoculación con Glomus deserticola dió también excelentes resultados en este tipo
de material (Azcón-Aguilar et al.,
1992) así como en el portainjerto RR-86 (un árbol procedente de semilla de 2
años de edad y que había mostrado cierta tolerancia
a P. cinnamomi). En este caso la longitud del brote se triplicó en las
plantas micorrizadas, observándose también un drástico incremento del área de
hoja (de la Viña et al., 1996).
Aplicaciones
del cultivo de ápices caulinares en la multiplicación de portainjertos
tolerantes a patógenos de suelo
En la actualidad se está evaluando la tolerancia a Rosellinia necatrix de plantas de
semilla procedentes de genotipos seleccionados en los bancos de germoplasma de
Ixtapan de la Sal y Coatepec Harinas (México) así como de la Estación
Experimental La Mayora (España). El material juvenil seleccionado se propagará
siguiendo la metodología de Barceló–Muñoz et
al. (1990) para realizar estudios adicionales en relación con su tolerancia
a Rosellinia necatrix. Paralelamente,
se están realizando prospecciones, para localizar árboles escape, en zonas del
Sur de España infectadas con este patógeno. Estos árboles adultos tras ser
sometidos a podas severas se propagarán siguiendo la metodología de
Barceló–Muñoz et al. (1999).
La obtención de callo embriogénico ha sido
previamente descrita en aguacate (Mooney y van Staden, 1987; Pliego-Alfaro y
Murashige, 1988). Para inducir este tipo de callo son requerimientos esenciales
la utilización de embriones cigóticos inmaduros y la incorporación de la auxina
picloram. Perán-Quesada y Sánchez-Romero (datos no publicados) han obtenido
cultivos embriogénicos de los cultivares Hass, Anaheim y Duke 7. Los callos
embriogénicos proliferan mejor en medio líquido que en sólido; sin embargo, en
medio líquido el material degenera más rápidamente por lo que es recomendable
alternar ambos tipos de medio o, si se pretende mantener los callos durante un
largo periodo de tiempo, utilizar únicamente medio sólido. La maduración de los
embriones ocurre en oscuridad después de transferir los callos embriogénicos a
medio sin auxina pero suplementado con leche de coco (10%). Sin embargo, a
pesar de que se forman estructuras blanco-opacas de considerable tamaño (10-20
mm), la formación de brotes o raíces sólo ocurre en raras ocasiones.
Los intercambios hídricos entre el embrión y su
medio juegan un papel fundamental en el proceso de maduración (Adams y Rinne,
1980). Así, se ha visto que la incorporación al medio de cultivo de sustancias
osmóticamente activas o de ABA, tiene efectos beneficiosos en el proceso de
maduración del embrión (Finkelstein y Crouch, 1986; Roberts, 1991). Estas
sustancias osmóticamente activas no causan necesariamente un incremento del
contenido de ABA endógeno (Morris et al.,
1988) o inducen los mismos cambios en el contenido hídrico (Welbaum et al., 1990). Según Benech Arnold et al. (1991), ABA endógeno y agentes
osmóticos en el medio pueden actuar de manera complementaria para impedir la
germinación precoz. En mango, Pliego-Alfaro et al. (1996a) han mostrado que
altas concentraciones de ABA (750-1750 mM), manitol (7,5-12.5%) o baja temperatura (7.5ºC)
detienen el desarrollo de embriones nucelares. En cultivos embriogénicos de
esta especie, la incorporación de ABA y manitol al medio de cultivo mejora la
calidad de los embriones somáticos obtenidos (Pliego-Alfaro, 1996b). En la
actualidad estamos estudiando los efectos del ABA, PEG y manitol, en el proceso
de maduración de embriones somáticos de aguacate para mejorar la tasa de
conversión en plantas. Paralelamente se trabaja en la puesta a punto de un
protocolo para la obtención de callo embriogénico a partir de tejido nucelar.
Aplicaciones
DE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN LA OBTENCIÓN DE MATERIAL TOLERANTE A PATÓGENOS DE suelo
Las enzimas
hidrolíticas b-1-3
glucanasa y quitinasa juegan un importante papel en reacciones de defensa
frente a patógenos fúngicos debido a sus efectos en la degradación de paredes
celulares de hongos (Jach et al.,
1995). Punja y Raharjo (1996) han incrementado la tolerancia a distintos
patógenos fúngicos de zanahoria usando un gen de quitinasa de tabaco, pero no
tuvieron éxito cuando utilizaron un gen de quitinasa de petunia. Estos autores
concluyeron que el tipo de quitinasa expresado, el patógeno fúngico y la
especie en cuestión afectan a la respuesta final. Por otra parte, parece
aceptado que la sobreexpresión simultánea de quitinasa y glucanasa es muy
efectiva en el incremento de la tolerancia a patógenos (Jach et al., 1995; Zhu et al., 1994).
Experimentos de control biológico realizados en
aguacate han puesto de manifiesto que Trichoderma
spp. son hongos antagonistas efectivos en el control de Rosellinia necatrix (Freeman et
al. 1986; Sztejnberg et al.,1987).
Este efecto antagonista de Trichoderma ha sido confirmado por miembros de nuestro
grupo de trabajo (Dr. Monte, Universidad de Salamanca; Dr. Llobell, Universidad
de Sevilla y Dr. Lopez-Herrera, CSIC, La Mayora, Málaga) mediante experimentos
en los que se utilizaron cultivos en placa de ambos patógenos. En la actualidad
están en marcha los trabajos encaminados a aislar los genes de Trichoderma responsables de este efecto antagonista para transformar callo embriogénico y obtener plántulas con mayor
tolerancia a Rosellinia necatrix.
Nuestros trabajos de investigación sobre aguacate
han sido financiados por el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología
Agraria y Alimentaria, Proyectos INIA 8186, INIA SC-98-042 y la Comisión
Interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT), Proyecto AGF 95-0588-C02-01.
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